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超濾離心管使用注意事項

  • 發(fā)布日期:2023-02-09      瀏覽次數:884
    •   超濾離心管常用于做細胞培養上清的蛋白濃縮的實(shí)驗,備有四種材質(zhì)的超濾膜:聚醚砜、三醋酸纖維素、再生纖維素和Hydrosart,可根據不同要求靈活選用。最近使用超濾管,由于管子較貴,想重復用幾次,但找不到可靠的資料。不知如何清洗和保存,比如有人說(shuō)用疊氮hua鈉,有人說(shuō)用氫氧化鈉,有人說(shuō)用乙醇浸泡。莫衷一是。很急用。
       
        超濾離心管使用注意事項:
       
        (1)選擇合適的超濾管。通常應截留分子量不應大于目的蛋白分子量的1/3,比如目的蛋白分子量為35kDa,就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右,則可以用截留分子量3kD的超濾管。認真閱讀使用說(shuō)明書(shū),注意超濾膜對各種化學(xué)物質(zhì)的耐受程度有所不同。
       
        (2)新買(mǎi)來(lái)的超濾是干燥的,使用前加入超純水,水量wan全過(guò)膜,冰浴或冰箱里預冷幾分鐘。然后將水倒出,即可加入蛋白液,加入的多少,以不超過(guò)管頂的白線(xiàn)為準。操作要輕,加入蛋白液前,超濾管需要插在冰上預冷。
       
        (3)平衡。質(zhì)量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快,否則直接損壞超濾膜。開(kāi)始離心超濾(離心機預冷至4度)。不同離心機的轉速 rpm換算成g之后,有所不同。離心機的加速度調至低檔,減小對膜的壓力。注意,一定要等離心機達到目的轉速之后,方可離開(kāi)離心機,否則離心機出問(wèn)題時(shí),無(wú)法第一時(shí)間處理。膜與轉軸的方向根據說(shuō)明書(shū)調整(角轉離心機的情況是膜與軸垂直)。在實(shí)際使用中,一般轉速開(kāi)的比說(shuō)明書(shū)里的要低,這樣可以延長(cháng)離心管的使用壽命。
       
        (4)當濃縮到剩下1ml時(shí),取50ul緩沖溶液,加入10ul流穿,看有沒(méi)變藍色,以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了,將上層和流穿重新倒入新管中開(kāi)始超濾。要精確判斷是否漏管,用5mgml的BSA離心10min,再取流穿,跑蛋白膠或Bradford粗測,繼續加入剩下的蛋白液濃縮(在冰上操作,防止蛋白受熱),直到所有濃縮液都加完為止。離心過(guò)程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀,導致堵管。若發(fā)生沉淀,要確定沉淀的具體原因,是蛋白濃度過(guò)高還是Buffer不合適;前者可用多根超濾管同時(shí)超濾,后者的方法是換不同的緩沖溶液,直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。
       
        (5)前面幾步用以濃縮蛋白,如果要換Buffer,在總蛋白液濃縮至1ml左右的時(shí)候,輕輕加入新的Buffer(經(jīng)0.22um超濾膜超濾),再 濃縮至1ml左右,連續三次,后一次的濃縮終體積根據需要的蛋白濃度而定,一般不多于500ul,也有濃縮至200ul以?xún)鹊那闆r。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算,三次達到1000倍以上,基本上可以達到換buffer的目的。
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